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流式细胞术中细胞培养和刺激的基本方法
日期:2014年12月31日 信息来源:深圳市纽邦生物科技点击率:1871

流式细胞术中细胞培养和刺激的基本方法

细胞活化的最终结果是产生细胞因子,根据检测指标和标本的不同,研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间,以获得最佳的实验结果。下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。

1、细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法

检测细胞因子

阳性对照刺激方法

IFN-g

方法2 (4-24 小时)

TIMP-1

方法5

aTNF-

方法7 (6 小时)

IL-1a

方法3 (6 小时)

bIL-1

方法3 (24 小时)

IL-2

方法2 (4-24 小时)

IL-4

方法4

IL-5

方法1

IL-6

单核细胞:方法3 (6-12 小时) T细胞:方法6

IL-10

方法1

IL-12

方法8

IL-15

方法3

Fractalkine/CX3CL1

方法1

IL-8/CXCL8

方法3 (24 小时)

MCP-1/CCL2

方法3 (24 小时)

MIP-1a/CCL3

方法3 (24 小时)

MIP-1b/CCL4

方法3 (24 小时)

RANTES/CCL5

方法1

小鼠IL-2

方法9

小鼠IL-4

方法10

小鼠IL-5

方法10

小鼠IL-6

方法11

小鼠gIFN

方法9 or 方法12

小鼠TNF-γa

方法9

为防止细胞内细胞因子分泌到胞外,在培养的最后4-6个小时,需要使用蛋白转运抑制剂 (3uM monensin10mg/mlBFA)

方法1:  只使用转染细胞检测。

方法2: 人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时。

方法3: 人的PBMC 使用LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激24 小时。

方法4: 人的PBMCs或者纯化的CD4+细胞在包被人CD3抗体的培养板中,使用含有10 ng/ml重组人的IL-2peprotech,目录号200-02)和10 ng/ml IL-4peprotech,目录号200-04)的培养基培养两天; 细胞洗涤后在含有重组人IL-2IL-4的培养基中继续培养2天; 最后收获细胞,使用PMA (10 ng/ml) Ionomycin (1 uM)刺激6小时。

方法5: CD4+ T 细胞使用PHA (10 ng/ml) 刺激天。

方法6: T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1b (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1)

方法7: 使用PMA (50 ng/ml) Ionomycin (500 ng/ml)刺激。

方法8: PBMCs细胞使用10 ng/ml重组人IFN-γ(peprotech,目录号300-02) 刺激小时,然后使用IFN-γ(10 ng/ml) + LPS (1 ug/ml) 刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞。

方法9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗体(25 ug/ml) 的培养板中,使用抗CD28 抗体(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小时。

方法10: CD4T细胞在包被小鼠CD3(25 ug/ ml)抗体的培养板中,使用含有抗小鼠的CD28(2 ug/ml)的抗体,10 ng/ml的重组小鼠IL-2 peprotech,目录号212-12) 和50 ng/ml 的重组小鼠IL-4 peprotech,目录号212-14)的培养基培养两天;然后在含有重组小鼠IL-2IL-4的培养基中继续培养3天;最后收获细胞,使用PMA(5 ng/ml)Ionomycin(500 ng/ml)monensin刺激6小时。

方法11: 小鼠巨噬细胞使用1 ug/ml LPS 刺激24小时。

方法12: 小鼠脾细胞使用PMA (5 ng/ml)Ionomycin (500 ng/ml)刺激6小时。

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