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细胞培养常见问题总结
日期:2015年06月09日 信息来源:深圳市纽邦生物科技点击率:1608

  1.如何储存和解冻血清才不会使产品质量受损
 
  建议血清应保存在-2O℃。若一次无法用完一瓶,无菌分装血清至恰当的灭菌容器内,再放回冷冻。 
 
  将血清从冷冻箱取出后,置于28℃冰箱使之缓慢融解,一般是融解过夜。 
 
  2、血清中包含絮状沉淀,它们是什么,怎么处理
 
  沉淀主要成分是纤维蛋白和脂蛋白,不会影响血清品质。 
 
  首先让其沉淀在瓶子底部,中上层无沉淀血清直接转出使用,下层血清装到50ml无菌离心管,400g,离心3分钟即可除去 (一般不建议采用过滤的方法除去沉淀,因为沉淀会堵塞滤膜而无法过滤) 
 
  3、实验室如何选择适合的血清
 
  稀有的澳洲血清培养娇贵细胞(小鼠ES、原代细胞分离培养),南美血清或国产胎牛血清用于癌细胞、常规细胞系培养(用量最大),新生牛血清用于病毒包装(构建稳转细胞株) 
 
  4、微生物培养基中添加了血清和抗生素后,可长期保存吗
 
  一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,您应该在两周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。 
 
  5、有必要做热灭活吗
 
  实验显示,经过正确处理的热灭活血清,对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是小黑点,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在37℃环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者误认为是微生物的分裂扩增。 
 
  若非必须,可以不需要做热处理这一步。不但节省时间,更确保血清的质量
 
  6、细胞培养中出现黑点是污染吗?如何处理
 
  一旦您在细胞培养的过程中发现有黑点生成,首先,要肉眼观察微生物培养基是否混浊,然后,在镜下观察培养细胞生长的状态,黑点是否游动。如果细胞被污染,微生物则会大量繁殖,微生物培养基就会迅速变黄、变混浊。污染包括细菌污染、支原体污染等。 
 
  如果在镜下观察细胞,生长状态良好,与黑点出现前相比,没有任何变化,那么,黑点的出现可能与以下几种情况有关: 
 
  (1)细胞生长过老,破碎的细胞残骸
 
  (2)血清质量不好,反复冻融的结果
 
  (3)配制培养基的pH值偏高,不宜细胞生长
 
  (4)培养原代细胞中出现小黑点,可能是原代组织中的杂质,多次传代可以消除。 
 
  7EDTA在细胞消化过程中起什么作用
 
  EDTA是一种螯合剂,它可以螯合Ca2+ Mg2+,而细胞表面很多和培养皿或培养瓶结合的蛋白都是带有Ca2+ Mg2+的,把这些离子螯合后,可以加速细胞和培养皿的脱离,促进消化。上皮类细胞的连接存在桥粒结构,是细胞间最牢固的连接,但桥粒的形成依赖于钙离子的存在。在胰酶消化细胞时,加入EDTA,可以破坏细胞的桥粒结构,使细胞能够分散成单个细胞。通俗地说,就是破坏细胞间的粘连。 
 
  8、如何选用特殊细胞系培养基
 
  培养某一类型细胞没有固定的培养条件。首选DMEM做贴壁细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养。另外还可以参考ATCC网站的推荐信息。 
 
  9、怎样让细胞适应新的条件
 
  从原条件逐渐过度:1/41/23/4,最后是完全新培养基。 
 
  10、为何微生物培养基保存于4℃,颜色会偏暗红色
 
  1.培养基内之CO2会逐渐溢出,造成微生物培养基越来越偏碱性。颜色也会随碱性增加而更偏暗红。 
 
  2.培养基偏碱之结果,将造成细胞生长停滞或死亡。需调整pH值至~7.2. 
 
  11、细胞冻存管应如何解冻
 
  37℃1~2分钟内全部融解。 
 
  冷冻管建议放在液氮液面上面,由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全(戴护目镜),预防冷冻管之爆裂。 
 
  12、培养细胞不贴壁?怎么办
 
  可能原因: 
 
  (1)胰蛋白酶消化过度 
 
  (2)支原体污染 
 
  (3)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不当 
 
  (4)细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性
 
  (5)接种细胞起始浓度太低或太高 
 
  解决办法: 
 
  (1)缩短消化时间或降低胰蛋白酶浓度 
 
  (2)如发现支原体污染,及时丢弃培养物。 
 
  (3)重新配置消化液或培养液 
 
  (4)复苏新的保种细胞 
 
  (5)调节最佳接种细胞浓度

 

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