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如何验证抗体的特异性?
日期:2015年09月23日 信息来源:深圳市纽邦生物科技点击率:2773
    现在,生物学家都意识到基础研究的重复性存在问题。也许,一部分的责任在于抗体,这也推动了抗体的验证工作。尽管用户有责任验证抗体,但制造商同样有责任。近日,Bethyl Laboratories的Sharon Bonnette博士在《BioTechniques》上介绍了一种验证抗体的目标特异性的高通量方法。虽说生物医学研究的重复性不是太高,但如果说低于50%,你也许不相信。不过根据6月发表在《PLOS Biology》上的一篇文章,情况确实如此。根据Amgen团队的研究,近90%公开发表的成果,如通路和癌基因,无法由Amgen的科学家重复。这不仅浪费了研究经费,也大大拖延了科学发现。
   在蛋白质研究中,研究人员高度依赖于商业化的抗体。据统计,大约95%的抗体用户依赖预先制备的抗体。遗憾的是,科学家并不信赖这些抗体,而厂商的验证通常被认为是“不够,也不可靠的”。因此,他们在购买抗体时,不仅要花很多钱,也要花很多的时间来挑选。
对于制造商而言,制备抗体并不是限速步骤。主要的限制在于证明它们能识别预定的目标,并确定它们的效价。为了制备出合格的试剂,制造商在高通量的制备之后必须加上高通量的验证。为了实现这一点,Bethyl Laboratories利用一种高效的检测来正确识别WB中的目的条带,并验证抗体特异性。这项检测包括WB和免疫沉淀(IP)分析,使用了针对同一目标蛋白的不同表位的抗体。 
    他们设计并合成了二到四个不同的肽段抗原,然后在兔子中制备了针对不同抗原的抗体,并进行纯化。之后,他们开展了IP和WB分析。每个抗体被用在独立的反应中,以便将阳性裂解液中内源表达的目标蛋白免疫沉淀。随后在SDS-PAGE胶上分离免疫沉淀物并转印。
在抗体孵育过程中,他们使用了表位特异性的抗体。通过远端表位抗体识别出的条带被认为是预期的目的条带。一旦目标条带被确定,这些抗体将接受进一步的检测,以评估它们在WB中的性能和特异性。这个抗体必须识别特定的目的条带,并表现出最小的交叉反应性,才算合格。

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